Il gioco inizia con una sequenza che funge da tutorial, dove Spidey dovrà aiutare le persone per le strade di New York City che gli chiedono aiuto. Successivamente si recherà in un locale in città, dove lo aspetta una festa per il suo compleanno organizzata dai suoi amici Mary Jane Watson e Harry Osborn. In seguito Peter conosce anche il Dr. Otto Octavius, amico del suo professore Dr. Connors e dedito ad un'iniziativa rivoluzionaria riguardante la fusione nucleare, che presenterà nei giorni successivi.

Nel capitolo successivo Peter dovrà consegnare delle pizze per conto di Mr. Aziz in una sequenza a tempo, facendo però attenzione a non volteggiare troppo, cosa che rovinerebbe il cibo. Compiuta la missione, il giovane si renderà conto di essere in ritardo per l'appuntamento preso con Mary Jane il giorno del suo compleanno. La ragazza è infatti arrabbiata con lui, ma Peter è costretto a liquidarla velocemente perché ha visto con la coda dell'occhio dei criminali entrare in un museo. Sconfitti i criminali, la sua attenzione viene rapita da una misteriosa donna vestita di nero, la quale, dopo averlo provocato, fugge dalla zona, facendo intuire all'Arrampicamuri che si tratta di una ladra.

Mentre è impegnato a scattare le foto della città dall'Empire State Building, Spider-Man si accorge che Rhino è a piede libero in città. Sconfitto Rhino, Peter viene liquidato da J. Jonah Jameson che inizialmente rifiuta persino le foto della città volendo piuttosto le foto di Spiderman. Il giornalista inoltre si compiace nel leggere di un certo Quentin Beck, un esperto di effetti speciali di Hollywood il quale ha pubblicamente sfidato Spiderman per dimostrare la falsità dei suoi superpoteri. Spidey va quindi a scattare delle altre foto per il Bugle quando sente l'allarme di una gioielleria suonare. Si reca sul posto e scopre che è opera della ladra vestita di nero, la quale finalmente viene raggiunta e si presenta come la Gatta Nera. Spider-Man accetta anche la sfida di Beck, battendolo in una serie di prove al Madison Square Garden e umiliandolo pubblicamente. Peter si reca poi alla dimostrazione tenuta dal dottor Octavius sulla fusione, ma questa finisce in disastro quando il "Sole" artificiale dell'esperimento fuoriesce dal campo di contenimento. Cambiatosi nei panni di Spider-Man, il protagonista spegne l'arnese e riesce a salvare il dottore, al quale però restano attaccati alla schiena i quattro bracci intelligenti usati per entrare in contatto col sole, mentre Rosie, la moglie di Octavius, muore nell'incidente, e Octavius stesso viene preso dall'odio per Spider-Man in quanto lo ha creduto responsabile di tutto.

Poco tempo dopo, dei giornalisti restano bloccati in un teatro assaliti da un alieno che si presenta come Mysterio, il quale annuncia di essere intenzionato a conquistare il mondo. Salvati i reporter, Spider-Man affronta un incredibile numero di UFO, che puntano la Statua della Libertà avvolta con un ologramma che le dà le fattezze di Mysterio. Spider-Man colpisce allora il cervello alieno che si trova sul capo della statua, facendo svanire l'ologramma. Mysterio invita poi Spider-Man a raggiungerlo nella "Casa dei divertimenti mortali", una specie di circo degli orrori nascosto in un appartamento da cui sarà difficile uscirne vivi. Dissoltasi l'ennesima illusione, Mysterio si ritroverà senza un buon piano e si vedrà costretto a fuggire.

Intanto Octavius, divenuto ormai il terribile Dottor Octopus, si è risvegliato dal coma e aggredisce Connors per poi rapinare una banca, la stessa in cui Peter e zia May avevano un appuntamento. Spidey lo raggiunge e lo sconfigge insieme ai criminali che lo affiancano, e Octavius per risposta rapisce zia May e la lascia sulle rotaie di un treno, obbligando Spider-Man a salvarla e a farlo fuggire. Intanto Mysterio sta tentando di rapinare un negozio, ma viene raggiunto dall'Arrampicamuri che a sorpresa lo sconfigge con un solo colpo, e dopo avergli tolto il casco scopre che si tratta di Quentin Beck, che viene arrestato. Nel frattempo Octavius vuole finire il suo lavoro, e raggiunge Harry per ricattarlo e chiedergli altro tritio, la sostanza necessaria per l'esperimento. Harry per salvarsi gli propone di portargli Spider-Man vivo e in cambio gli darà ciò che vuole: Octavius accetta.

In seguito la Gatta Nera incontra Spider-Man e gli rivela che Shocker, che era uno dei detenuti usati per le prove di Beck, è riuscito a scappare. L'Arrampicamuri, aiutato dalla stessa Gatta Nera, lo raggiunge a Brooklyn per sconfiggerlo e risbatterlo al fresco, ma in seguito capisce di essere attratto dalla Gatta, cosa che mette in discussione i suoi sentimenti. Una sera la Gatta si incontra ancora con Peter e rivela che i criminali di New York hanno importato degli esoscheletri giganti dotati di mitra e missili e stanno organizzando un'asta. Dopo una dura lotta, i due eroi riescono a sconfiggere gli avversari. La Gatta in un impeto di passione prova a baciare l'Arrampicamuri, ma questi rifiuta le avances della ladra, che se ne va via. Peter capisce di essere davvero innamorato di Mary Jane e rintraccia la Gatta per spiegarle che non potranno mai stare insieme; lei capisce e gli dice che rimarranno comunque amici.

Proprio Mary Jane chiama Peter per incontrarsi e parlare di loro, ma viene rapita da Octopus, che fa così uscire Spider-Man allo scoperto. Lo scienziato deraglia un treno, e Spider-Man con molta difficoltà riesce a fermarlo, per poi svenire per lo sforzo ed essere preso da Octopus che lo porta a casa di Harry, che gli consegna il tritio. Rimasto solo, Harry toglie la maschera all'Arrampicamuri, e cade in preda allo sconforto quando si rende conto che si tratta di Peter. Quest'ultimo lo convince a rivelargli la posizione del nascondiglio dello scienziato. Raggiunge quindi Octopus, che tiene in ostaggio Mary Jane per attirarlo, e lo sconfigge dopo una dura lotta. Rinsavito, Octavius decide di sacrificarsi per distruggere la sua stessa creazione, permettendo anche a Peter e Mary Jane di salvarsi. Il giorno dopo, Peter riceve una visita a sorpresa da Mary Jane, che è fuggita dal matrimonio con il figlio di J. Jonah Jameson per confessargli i suoi sentimenti. Questo riempie Peter di gioia e di confidenza, e cambiatosi poi nuovamente nei panni di Spider-Man, si prepara a salvare la città per l'ennesima volta.