La storia inizia con una nuova banda, i Dinamitardi, più simile a un'organizzazione avanzata, che una sera fa esplodere il Carlyle Building, quando Spider-Man arriva per salvare le persone intrappolate e occuparsi dei cattivi.

Il gioco, come il capitolo precedente, presenta una New York completamente esplorabile in free roaming; si possono scegliere i crimini da combattere, le missioni da compiere e le mosse da utilizzare. Nel gioco Spider-Man si trova ad affrontare l'Uomo Sabbia, nuovo supercriminale comparso in città, e il suo ex migliore amico Harry Osborn che, seguendo le orme del padre, è diventato il nuovo Goblin. Infine il protagonista dovrà confrontarsi con il proprio lato oscuro, che verrà fuori con il famoso e potente costume nero.

Nella città sono visualizzate le missioni da compiere: gare da affrontare, posti da visitare e nella mappa sono evidenziate in rosso le parti della città con un alto tasso di criminalità; se ci si impegna a sconfiggere il crimine, la reputazione migliora e si è ricompensati dall'ammirazione dei cittadini, in caso contrario si è odiati dalla gente e si viene coperti di vergogna; inoltre il crimine si diffonde maggiormente e il compito diventa ancora più difficile.

L'Uomo Ragno col costume nero è più veloce, più potente e può fare delle spettacolari serie di combo; inoltre i suoi sensi di ragno sono potenziati e diventa più reattivo e letale.

Nella versione per PlayStation 3 del gioco è stato aggiunto un personaggio giocabile completamente diverso, ovvero il nuovo Goblin, che utilizza il suo aliante, controllabile con il Sixaxis, con cui può sfrecciare tra i palazzi a folle velocità. In più il videogioco in sé offre molti nemici oltre quelli del film, che variano a seconda della versione, tra cui: Shriek, Morbius, Kraven, Lizard, lo Scorpione, Rhino, Kingpin e Luke Carlyle.