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Al largo delle coste di Panama, Nathan "Nate" Drake recupera dal fondo dell'oceano la bara dell'esploratore e corsaro inglese, nonché suo antenato, Sir Francis Drake. L'evento è ripreso dalla giornalista Elena Fisher, la cui compagnia ha finanziato l'impresa per avere un buon documentario. Nella bara però non sono presenti le spoglie di Sir Francis, ma solo il suo diario (la cui ultima pagina è stata strappata) contenente la locazione di El Dorado. In quel momento, i due vengono attaccati da dei pirati, ma in loro soccorso arriva Victor Sullivan detto "Sully", amico di Nathan.

Liberatisi della giornalista, Nathan e Sully si recano in Colombia, dove secondo le informazioni contenute nel diario dovrebbe trovarsi El Dorado. Risalendo il Rio delle Amazzoni trovano un antico tempio Inca e scoprono che El Dorado non è una città, ma un'enorme statua d'oro, che però fu rimossa circa 400 anni prima del loro arrivo dai Conquistadores.

Seguendo le tracce sugli spostamenti della statua, il duo scopre un sottomarino tedesco risalente all'epoca nazista, incagliato da tempo nel Rio delle Amazzoni. Mentre Sully lo aspetta fuori, Nathan si addentra nel sommergibile, e al suo interno, trova la parte mancante del diario di Drake, per l'esattezza una mappa che rivela l'esistenza di un'isola nell'Oceano Pacifico dove la statua fu probabilmente portata. Uscito dal sommergibile, Nathan scopre Sully ostaggio di Gabriel Roman, un cacciatore di tesori che si avvale di mercenari tra i quali Atoq Navarro, un archeologo che conosce la leggenda della statua. Nonostante Nathan consegni la mappa appena trovata a Gabriel, questo spara comunque a Sully in petto. Nate è costretto a fuggire ma, mentre sta scappando, ritrova Elena, adirata per il fatto che l'abbiano abbandonata. Il duo rapidamente sale sull'aereo di Sully e si dirige verso l'isola dove si troverebbe la statua.

In prossimità dell'isola, il loro aereo viene colpito: per salvarsi si lanciano col paracadute, ma si dividono. Nathan si mette in cerca della ragazza. Esplorando l'isola avvista il paracadute di Elena, impigliato in un vecchio forte spagnolo, e decide di recarcisi, scoprendo che probabilmente la statua è arrivata sull'isola presso una colonia spagnola poco distante. Durante il tragitto viene catturato da Eddy Raja, un suo vecchio rivale ora dedito alla pirateria. Poiché è alleato di Roman, Eddy cerca di obbligarlo ad aiutarlo nella ricerca di El Dorado ma Nate viene liberato da Elena che, con una jeep, sradica la parete della prigione in cui si trovava. Fuggono insieme, inseguiti nella giungla, e si dirigono presso i resti della colonia spagnola: una città abbandonata e semi-sommersa dall'acqua. Mentre cercano il tesoro, le cose si complicano con l'arrivo sull'isola di Gabriel, Navarro e i loro mercenari, insieme a un redivivo Sully. Questi si inoltrano verso l'entroterra nella direzione di un vecchio monastero, quindi Nate ed Elena decidono di andare a recuperare Sully.

I due risalgono così il fiume e, giunti al monastero, si riuniscono a Sully che, sopravvissuto miracolosamente, finge di aiutare Gabriel e i suoi uomini fornendo loro false piste, mentre in verità ha trovato reali prove che il tesoro è stato portato fin lì. Nathan ed Elena esplorano le catacombe sotto al monastero dove si troverebbe la statua e lì sotto trovano lo scheletro di Francis Drake, lasciando Nathan scoraggiato poiché ritiene che l'antenato ha perso la vita senza neanche trovare il tesoro. In quel momento si imbattono in Eddy che fugge inseguito da esseri umani, mutati e vagamente simili a zombie, e dotati di incredibile forza e velocità. Eddy perisce sotto i loro attacchi, mentre Nathan ed Elena riescono a scappare e si ritrovano in una vecchia base tedesca costruita nell'isola durante la seconda guerra mondiale, poiché anche i tedeschi avevano provato a cercare El Dorado. Per proseguire serve ridare energia al bunker, quindi Nathan si avventura da solo nel complesso sfidando ancora gli esseri umani mutati. Dopo aver messo in moto il generatore, Nathan trova un filmato in cui vede come i tedeschi scoprirono la statua, ma non riuscirono a capire in tempo che in essa si celava quella che appariva essere una terribile maledizione, la quale aveva trasformato i soldati esposti in mutanti. Scopre anche, attraverso una lettera, come Francis Drake molto tempo prima sacrificò la sua vita e distrusse la colonia per impedire che la statua lasciasse l'isola, evitando la distruzione del mondo con i suoi effetti.

Nathan si appresta a tornare da Elena quando scopre che è stata catturata da Gabriel e Navarro, quindi affronta sia i mercenari di Gabriel sia i mutanti. Riesce a tornare da Sully e insieme si dirigono nel punto in cui è nascosto El Dorado per impedire che lasci l'isola. Tuttavia, arrivati alla statua, scoprono che è già stata trovata da Gabriel e dai suoi uomini. Navarro suggerisce a Gabriel di aprirla per trovarvi il "vero tesoro", così facendo scopre che la statua d'oro in realtà altro non è che un sarcofago contenente una mummia che rilascia delle spore. Dopo averle inalate, Gabriel si trasforma anche lui in un mutante, aggressivo e fuori controllo, ma viene subito ucciso da Navarro. Si scopre così che quest'ultimo conosceva la leggenda e il segreto di El Dorado fin dall'inizio, e che era alla ricerca del tesoro non per l'oro, bensì per il potere mutante delle spore da impiegare sulle persone per poi usarle come armi biologiche. In quel momento arrivano sul posto i mutanti, che fanno fuori tutti i mercenari presenti.

Tenendo ancora in ostaggio Elena, Navarro usa un elicottero per recuperare la statua, ma Nathan riesce a saltare al volo sul velivolo mentre Sully si occupa di eliminare i mutanti. L'elicottero però si schianta sul ponte della nave di Navarro. Durante la battaglia finale, Nathan riesce a liberarsi della statua buttandola in acqua e trascinando anche Navarro sul fondo del mare. Nathan infine salva Elena e, sul punto di baciarsi, vengono interrotti da Sully, che è riuscito a rubare una barca con un sostanzioso bottino d'oro per tutti e tre. Quando lasciano l'isola, Elena ricorda a Nathan che gli deve ancora una storia per il suo show e Nathan le promette che l'avrà.

• PRODOTTO USATO
• VERSIONE ITALIANA
• SOTTOTITOLI: INGLESE, ITALIANO, FRANCESE, TEDESCO, SPAGNOLO
• PARLATO: INGLESE
• SPEDIZIONE: TRAMITE CORRIERE ESPRESSO  IN 24/48 ORE
• OGNI GIOCO è NELLA SUA CONFEZIONE ORIGINALE